太原同济医院中医肿瘤科
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    丹参凝集素及胃癌细胞凋亡研究

    发布时间:2020-02-10  来源:未知  作者:木木

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    [摘要]目的中药活性蛋白具有抗肿瘤效应,丹参是重要的抗肿瘤中药。文章研究丹参凝集素蛋白(SMLP)诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法利用蛋白质原核表达系统在体外表达纯化SMLP,并作用于胃癌细胞SGC-7901。实验分为对照组(未处理)和SMLP处理组(终浓度10µmol/LSMLP处理24h),通过RT-PCR和Westernblot检测相关凋亡基因的表达变化,通过流式细胞术和Hoechst染色检测细胞凋亡情况,利用Caspase-3和Caspase-9活性检测试剂盒检测细胞凋亡水平。结果RT-PCR结果显示SMLP处理组Bax的mRNA水平(1.00±0.12)较对照组(0.67±0.10)明显升高(P<0.05)。胃癌细胞经SMLP处理后,剪切型的Caspase-3和Caspase-9的表达水平和活性较对照组明显增加(P<0.05)。对照组细胞核较大,较圆,表面光滑,染色均一。而SMLP处理组细胞,细胞核染色加深,固缩,出现了典型的凋亡形态学特征。对照组细胞早期凋亡水平为6.55%,而SMLP处理组细胞早期凋亡水平达到10.18%,细胞凋亡水平升高。结论体外表达纯化的丹参凝集素蛋白能够促进胃癌细胞SGC-7901凋亡,这对于进一步揭示植物凝集素的功能,以及研究中药活性蛋白抗肿瘤的作用具有重要意义。

    [关键词]丹参凝集素;胃癌细胞;凋亡

    胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率及死亡率都很高,其治疗手段主要有手术、化疗、靶向治疗及中医药治疗等[1-2]。中医药因其抗肿瘤效应、放化疗增敏以及减轻放化疗毒副方面独具效果而越来越受到人们的重视[3]。目前,中药抗肿瘤活性成分得到了大量的分离纯化,为中药抗肿瘤机制的研究提供了基础[4]。丹参作为常用的活血化瘀中药,在治疗心血管疾病方面具有良好的功效[5]。除此之外,丹参还被发现具有抗肿瘤功能,其主要有效成分包括丹参酮和丹酚酸类,多项研究表明丹参酮类具有抗肿瘤作用[6],但丹参中有功能的活性蛋白报道较少。我们的前期工作从丹参中分离鉴定了丹参凝集素蛋白(salviamiltiorrhizalectinprotein,SMLP),并通过分子克隆、蛋白质原核表达及蛋白亲和层析技术在体外得到了SMLP,并通过血细胞凝集实验,证明体外表达纯化的SMLP具有生物活性[7]。本文进一步研究了体外表达纯化的SMLP对胃癌细胞的促凋亡作用,我们发现SMLP能够明显促进胃癌细胞的凋亡,这对于进一步揭示丹参抗肿瘤作用的机制具有重要意义。

    1材料与方法

    1.1材料丹参凝集素原核表达载体pet-28a-sml(实验室构建);大肠埃希菌BL21感受态购于全式金生物公司;LB培养基,卡那霉素,异丙基硫代半乳糖苷Isopropylβ-D-Thiogalactoside(IPTG)购于上海生工;蛋白纯化相关试剂:镍柱(NiNTAbeads)和阴离子交换柱,购于GE公司;胃癌细胞系SGC-7901购于中科院上海细胞所;胎牛血清购于杭州四季青公司;RPMI‑1640培养基购于Hyclone公司;抗Bax、PARP(polyADP-ribosepolymerase)和GAPDH多克隆抗体购于武汉三鹰公司;抗剪切型的Caspase-3和Caspase-9抗体购于CST公司;PVDF膜购于Millipore公司;蛋白酶抑制剂、BCA检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒购于Pierce公司;Caspase-3和Caspase-9活性检测试剂盒,Hoechst33342染色试剂盒和AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于贝博公司。1.2原核表达载体pet-28a-sml构建丹参凝集素原核表达载体构建构成,如文献[6]所描述。以丹参叶片为材料,抽提总RNA,并反转录得到cDNA第一链。以cDNA为模板,通过PCR的方法体外扩增丹参凝集素基因sml,通过NheI和XhoI限制性内切酶及T4DNA连接酶将sml基因插入到原核表达载体pet-28a,成功构建pet-28a-sml原核表达载体。1.3SMLP的表达纯化将pet-28a-sml质粒转化感受态细胞BL21,将菌接种到含卡那霉素(50µg/mL)的LB培养基,37℃振荡培养至A值到0.8,加入诱导剂IPTG(0.5mmol/L),24℃诱导12h后,以离心半径12cm、5000r/min离心15min收集菌体,超声破碎后离心取上清与镍柱结合,纯化的蛋白经离子交换柱进一步纯化,浓缩到5mg/mL,过滤除菌,用于后续细胞实验。将体外纯化的SMLP进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色检测。SMLP包含213个氨基酸,体外表达的SMLP在其N端含有His标签,所以相对分子质量约为25000。1.4细胞培养将胃癌细胞SGC-7901培养于DMEM完全培养基,5%CO2、37℃和饱和湿度的培养箱中进行培养。将进入指数生长期的细胞接种于6孔板中,12h后进行分组,分别为对照组(未处理)和SMLP处理组(终浓度10µmol/LSMLP处理24h)。1.5Westernblot检测对照组和SMLP处理组细胞,用PBS液洗涤1次,加入150µL含蛋白酶抑制剂的RAPA裂解液裂解30min,10000×g,4℃离心10min,取上清并用BCA法测蛋白浓度,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,并将蛋白转印到PVDF膜,5%奶粉封闭1h后,加入一抗(1∶1000稀释),4℃孵育过夜,TBST洗膜3次后,HRP标记的二抗(1∶10000稀释)室温孵育1h,ECL化学发光试剂盒显色。1.6RT-PCR检测对照组和SMLP处理组细胞利用TRIzol(Sigma)提取总RNA,取2µg总RNA采用反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)反转录cDNA模板至终体积为20µL,采用SYBRGreen实时荧光定量PCR方法检测目的基因mRNA的表达。所用引物如下:Baxforwardprimer,5'-TTCCGAGTGGCAGCTGAGAT‑GTTT-3';Baxreverseprimer,5'-TGCTGGCAAAG‑TAGAAGAGGGCAA-3';GAPDHforwardprimer,5'-AAGGGAAGGTTGCTGGATAGG-3';GAPDHreverseprimer,5'-CACATCCACCTCCTCCACATC-3'。采用Bio-Rad荧光定量PCR仪,95℃3min;95℃30s,60℃30s,72℃30s,40循环,并收集溶解曲线。GAPDH作为内参基因,分析Bax的相对表达水平。1.7Hoechst染色对照组和处理组细胞加入4%的多聚甲醛固定30min,加Hoechst染色液,37℃孵育··5130min,PBS洗2次。将样品置于荧光显微镜下观察。激发波长350nm,发射波长460nm。观察细胞核形态变化,检测细胞凋亡情况。1.8Caspase活性检测Caspase-3酶活性通过Caspase-3酶活性检测试剂盒(贝博生物)来检测。Caspase-3能够催化底物OPC-DEVD-pNA产生黄色的产物pNA,利用分光光度计检测pNA在405欲钱买吃肉生肖是什么nm处的吸光值。Caspase-9酶活性检测利用Caspase-9酶活性检测试剂盒,Caspase-9可以催化底物Ac-LE‑HD-pNA产生黄色的产物pNA。具体操作步骤参照试剂盒说明书。用胰酶消化细胞,离心收集细胞,PBS洗涤1次后加入裂解液,冰浴裂解15min。离心收集上清,取100µL上清加到96孔板,每孔中加入底物10µL,37℃孵育2h后于405nm处检测吸光值,并除以各组的蛋白浓度得到单位蛋白中所含的Caspase-3和Caspase-9的酶活性单位。1.9统计学分析采用SPSS10.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量检测数据用均数±标准差(xˉ±s)表示,两组间比较用t检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。

    2结果

    2.1SMLP诱导凋亡基因表达水平升高与对照组相比,SMLP处理组的Bax蛋白、PARP蛋白以及剪切型PARP水平升高,见图1。RT-PCR结果显示SMLP处理组Bax的mRNA水平(1.00±0.12)较对照组(0.67±0.10)明显升高(P<0.05)。形态学特征,见图3。2.4SMLP促进胃癌细胞凋亡水平增加对照组细胞早期凋亡水平为6.55%,而SMLP处理组细胞早期凋亡水平达到10.18%,细胞凋亡水平升高。该结果表明SMLP能够促进胃癌细胞凋亡。见图4。

    3讨论

    细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序死亡一个过程[8]。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一个重要策略。目前多种化疗药物都是通过诱导肿瘤细胞凋亡,但其毒性较大且容易产生耐药性[9-10]。中药及其活性成分具有毒副作用小,药理作用独特等特点,广泛地应用于肿瘤治疗[11]。本文研究的是从丹参中分离得到了新的活性蛋白成分丹参凝集素,多项研究表明植物凝集素能够诱导肿瘤细胞凋亡、自噬以及抑制肿瘤生长[12-13]。目前多种植物凝集素被分离纯化,如刀豆凝集素、花生凝集素、大豆凝集素和槲寄生凝集素等[14-16]。因丹参基因组已经测序,我们利用分子克隆技术及蛋白原核表达系统,在体外表达化了丹参凝集素蛋白SMLP,并研究了SMLP的抗肿瘤活性。我们发现SMLP能够明显促进凋亡相关基因Bax的表达上调。Bax是线粒体凋亡途径的重要因子,当细胞受到凋亡信号刺激后,Bax发生构象改变,移位到线粒体外膜,并改变线粒体膜通透性,促进细胞色素C释放。Bax的表达增加,促进Caspase-9的剪切并激活。Caspase-9在细胞凋亡信号转导过程中发挥起始作用,激活的Caspase-9可以剪切并激活细胞凋亡的最关键酶Caspase-3,使其底物PARP被切割而失去DNA修复的功能,从而使细胞发生凋亡,并产生细胞形态的明显改变[17]。根据我们的结果,SMLP处理组胃癌细胞,Caspase-9和Caspase-3的剪切型和活性都是增加,同时PARP的剪切型也明显增加,说明SMLP能够促进胃癌细胞凋亡。Hoechst染色进一步表明SMLP能够明显改变胃癌细胞形态,引起细胞核固缩,流式细胞术也显示SMLP能够诱导胃癌细胞早期凋亡。综上,我们的结果表明体外表达纯化的SMLP能够促进胃癌细胞凋亡,可能是通过线粒体凋亡途径。SMLP可能通过与细胞表面的糖蛋白受体结合,激活了凋亡信号通路。下一步我们将通过蛋白质相互作用方法His-pulldown结合质谱鉴定找寻SMLP结合的膜受体,并检测多条细胞信号通路的改变,除此之外,我们还将在其他胃癌细胞系及其他肿瘤细胞研究SMLP的抗肿瘤活性,以期揭示SMLP诱导肿瘤细胞凋亡的确切机制。本研究进一步揭示了丹参的新的抗肿瘤活性成分及新的机制,也为SMLP的后续研究及临床应用提供了基础。

    作者:牛成群 覃韦宁 谷春明 汪雄 吴胜英 李珊 武福云




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