太原同济医院中医肿瘤科
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    自噬水平对卵巢癌细胞顺铂的效果

    发布时间:2020-02-10  来源:未知  作者:木木

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    【摘要】目的探究Beclin1自噬水平的调控在顺铂治疗卵巢癌患者中对其敏感性的干预效果及相关机制研究。方法通过脂质体对自噬基因Beclin1RNA中的干扰质粒喝对照质粒分别进行转染,转染细胞为卵巢癌细胞A2780/DDP,之后选择转染稳定的表达株,观察顺铂作用下正常、干扰转染、对照转染三组细胞的自噬凋亡情况,并对生长抑制率及抑制浓度进行对比分析探讨相关作用机制。结果研究结果证实,转染细胞组细胞内部Beclin1蛋白的表达显著降低,48h内测定三组细胞生长抑制率结果证实,干扰转染组细胞的IC30-最低,数据差异有统计学意义(p<0.05);电镜结果发现顺铂作用下,通过抑制Beclin1的表达细胞自噬功能有显著的降低,凋亡进程加快同时凋亡蛋白的表达含量显著升高,组间对比证实有统计学意义(p<0.05)。结论通过抑制耐药细胞A2780/DDP自噬基因Beclin1的表达水平能够有效对自噬凋亡基因进行调控,促进凋亡的同时增加了卵巢癌细胞对顺铂药物治疗的敏感性,有利于改善患者的预后,对拓宽临床治疗研究思路有重要意义。

    【关键词】Beclin1;自噬水平;卵巢癌;顺铂化疗

    卵巢癌是临床中女性发病率较高的恶性肿瘤疾病,有数据统计卵巢癌的发病率仅低于子宫颈癌及子宫体癌,主要发病类型多为上皮细胞癌,随着近年国外内学者对晚期卵巢癌化疗方案的研究,新辅助化疗的出现,为晚期肿瘤的治疗开辟了新的途径。新辅助化疗是指在首次接受手术治疗前对肿瘤患者进行全身性化疗,通过缩小原发病灶,减少病灶转移,可提高肿瘤切除率,有利于改善其预后[1-2]。目前在晚期卵巢患者的治疗中主要以卵巢肿瘤细胞减灭术为主,但受到病灶转移和种植等因素的影响,临床治疗效果不佳,近年来新辅助化疗联合减灭术取得了一定的研究和治疗效果,能够有效改善患者的预后[3]。自噬对肿瘤的作用是动态而且复杂的,因肿瘤的类型、肿瘤的分期不同都会对自噬的作用产生影响[4]。自噬通过定义为三种形态,即巨、微以及介导自噬,自噬基因同肿瘤疾病存在较大的联系,机制较为复杂,近年来临床研究进行了大量的论证以期探讨自噬基因Beclin1在卵巢癌化疗患者中的关系,掌握其具体的机制并对病程发展、转移和患者预后进行预测,是卵巢癌临床治疗的新领域[5],本次研究主要分析通过调控自噬基因Beclin1的表达对顺铂治疗卵巢癌患者化疗敏感性的影响。现将结果报道如下。

    1材料与方法

    1.1材料制备与培养本课题研究中卵巢癌耐药细胞株A2780/DDP由四川大学华西医院实验中心保种,该耐药细胞株在长期小剂量顺铂药物刺激作用下于卵巢癌细胞株A2780培养而出,采用浓度含量为10%的小牛血清高糖培养基在环境温度为37摄氏度CO2浓度为5%的孵化箱中进行表达株的培养。1.2流失细胞仪测定方法将正常、干扰转染、对照转染三组细胞按1×10/mL密度分别接种于6孔板中,在40M顺铂作用下,置入5%CO2孵箱37℃培养48h,常规消化成细胞悬液。冰PBS洗涤2次,75%冰乙醉4℃固定,制备细胞悬液,加入10AnnexinV-FIC和10碘化丙啶(PI)(AnnexinV-FTC细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品),混匀。流式细胞仪检测细胞凋亡率。调亡细胞定义为AnnexinV+/P细胞。试验重复3次,取均数比较。1.3Beclin1蛋白测定方法将pSUPER-Beclin1、PSUPER-non和空白对照组细胞按1×10/mL密度分别接种于6孔板中;PBS洗涤两次,六孔板每孔中各加入细胞组织裂解液(RPA)100μl,加入3种蛋白酶抑割剂(pepstatinA、aprotinin、leupeptan)各0.5μ,用细胞刮收集细胞于离心管中,冰浴放置30min,4℃,14000r/min,离心15min,取上清,测蛋白质浓度。每个浓缩胶孔内上样80μg总蛋白,一抗为兔抗人Beclin1多克隆抗体BECN1(用封闭液按1∶1000稀释),二抗为辣根过氧化物帮标记的羊抗兔IgG(用封闭液按1∶5000稀释)。1.4自噬细胞的观察分别收集10μM顺铂作用48h后的A2780细胞和40uM顺铂作用48h后的A2780/DDP细胞制成单细胞悬液以2000r/min离心15~20min弃上清,4℃预冷的PBS洗3次。沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液在4℃环境中静置30~60min冷PBS洗3次A0min/次。1%四氧化锇4℃再固定15~30min,梯度丙酮溶液逐级脱水Epon812包埋半薄切片光学定位超薄切片醋酸铀及枸橼酸铅双重染色[6],在日立-60ⅣV型透射电镜下观察自噬囊泡。1.5统计学处理研究数据采用SPSS21.0软件对相关数据进行统计处理,计数资料(n,%)以频数(百分数)[n(%)]表示,采用χ2检验;计量资料以均数±标准差(x珋±s)表示,采用t检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。

    2结果

    2.1流式细胞仪测定对比流式细胞仪检测结果证实,A2780细胞再顺铂作用下10μM浓度含量时细胞凋亡率在53.67±2.13%区间范围内,两组细胞测定结果均与正常细胞的抑制率较为接近,具体结果详见图1、图2。2.2生长抑制作用对比不同顺铂剂量作用下,卵巢癌细胞A2780/DDP的生长抑制率存在较大的差异,干扰转染细胞不同顺铂剂量的生长抑制率均高于对照转染及正常细胞,组间两两比较采用t检验,差异均有统计学意义(均P<0.05)。具体结果详见表1。2.3Beclin1蛋白变化经Westernblot检测Beclin1蛋白的表达,发现对照转染与干扰转染两组细胞中的A2780/DDP明显降低,A2780细胞作用前后未见明显的变化,具体结果详见图3。2.4自噬细胞变化对比顺铂作用后的48h进行电镜下观察,A2780/DDP细胞内部可见有多个自噬体形成,形状表现为线粒体等细胞器,由双层或多层膜组织包裹,A2780细胞内部在顺铂作用后少有自噬体形成,细胞表现为胞浆浓缩、核碎裂等主要凋亡特征。具体结果详图4、图5。2.5凋亡细胞IC30表达对比正常、干扰转染、对照转染三组细胞进行组间两两比较凋亡细胞IC30表达含量,正常组细胞表达为(44.03±1.28)/μm,对照转染细胞中凋亡细胞的表达含量为(43.95±1.27)/μm,组间数据检验结果差异无统计学意义(P>0.05),干扰转染细胞中凋亡细胞IC30表达含量明显降低(9.49±0.87)/μm,同正常组细胞进行组间比较,结果差异明显,有统计学意义(P<0.05)。

    3讨论

    卵巢肿瘤的结构极为复杂,部分研究指出卵巢良性肿瘤若不给予有效的治疗措施会导致肿瘤恶变发生,包括发生卵巢癌以及其他生殖器官肿瘤,导致临床治疗难度加大,同时患者的治愈率明显降低[7]。前期无明显症状表现的患者可突然发生剧烈的腹部疼痛,必须及时送往医院进行手术治疗,避免出现肿瘤坏死、卵巢破裂以及严重感染发生。卵巢癌是女性生殖器官中常见的恶性肿瘤之一,临床发病率仅低于子宫颈癌与子宫体癌,排列第3[8]。因该病早期无典型症状,大部分患者就诊时已属晚期。其治疗原则应尽早进行手术,并规范化疗方案。卵巢恶性肿瘤因病理类型不同而治疗方案不同,但对晚期卵巢癌患者而言,其肿瘤扩散范围广,邻近组织浸润严重,难以准确分离肿瘤,给手术治疗带来一定困难。Survivin具有肿瘤特异性,只表达于肿瘤和胚胎组织,且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关,Survivin参与了细胞凋亡的过程。P53是一种人体抑癌基因,还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能,表达后形成一种在正常卵巢组织中无法存在的糖蛋白,常见于上皮性卵巢肿瘤中。80%的卵巢上皮性肿瘤患者血清CA125升高,因此CA125也为卵巢癌的特异性标志物[9]。最初有学者认为自噬、凋亡程序性细胞的死亡方式无论是在生化指标、形态方面,还是在参与分子方面、机理方面均存在诸多不同,但近期研究发现,两者之间的关系有着随复杂可能依生物学背景变化的关系,可见自噬、凋亡可在某种特殊情况下会产生相互拮抗或者相互促进的作用,也可先后发生在同一细胞或同时共存在同一细胞,同一诱导因素在不同细胞内诱发的自噬、凋亡情况均有所不同[11];参与自噬和凋亡的分子也可能存在交叉,这些分子在自噬与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥正向或负向作用。自噬形成的基本步骤如下:①细胞内可生成一种隔离膜、有吞噬作用的小囊泡样的结构,其中隔离膜可延伸、包裹胞浆,形成双层膜结构,可将其称为自噬体,自噬体、溶酶体可直接融合成自噬溶酶体,也可先与内涵体融合,生成自噬内涵体后与溶酶体相融合。包裹的成分需经溶酶体作用被降解[10]7435588金多宝资料。②经电镜直视自噬体形态变化,分析其与自噬相关蛋白,比如通过评价Beclin1,分析自噬对细胞的实际影响。近来有很多文献报道自噬基因Beclin1与卵巢癌的关系,但是仍没有统一的定论[12]。有相关研究指出[13],采用抑制剂处理的宫颈癌细胞株是通过调控bcl-2基因蛋白的表达来影响自噬形成的过程,并促成凋亡,通过调控凋亡Beclin1家族来阻止凋亡发生,而下调抗凋亡的Becn家族能在Hela细胞中快速诱导自噬的形成。Beclin1因其本身的特性是一种具有独特结构的多功能蛋白,在机体中发挥着凋亡以及自噬的调节作用,可认为通过调控Beclin1的高低表达可直接参与凋亡自噬过程,从而加速和缓解细胞自噬凋亡的进程,这对于肿瘤患者治疗以及预后改善均有重要意义。但目前相关研究仅涉及Beclin1在卵巢癌中的表达,关于调控和抑制其表达能够产生的效应的研究甚少,笔者结合前瞻性研究及国内外资料推断通过调控抑制Beclin1的表达能够提高癌细胞化疗的敏感性[14]。本次研究中,Beclin1基因在卵巢癌细胞中的表达呈现出敏感性升高,为进一步探讨其增敏的机制,调整了不同剂量的顺铂药物浓度对Beclin1基因中A2780/DDP细胞的变化情况进行了分析,结果得出干扰转染细胞组荧光测定强度要明显高于对照转染及正常细胞组,生长抑制率组间也存在较大的差异,检验结果均具有统计学意义(P<0.05),这证实了调控抑制Beclin1的表达后卵巢癌患者顺铂化疗过程中敏感性显著增加,细胞自噬能力相应减弱。除与Vps34结合调控自噬机制外,序列和结构研究提示Beclin1蛋白具有BH3结构域,可以直接与Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员Bcl-2、bcl-xL结合参与凋亡过程的调节,此次研究中,干扰转染细胞中的A2780/DDP在作用下调亡细比例明显高于对照转染组和未转染组,结果有统计学意义(P<0.05),说明抑制Beclin1的表达可提高耐药细胞A2780/DDP对顺铂化疗药物治疗的敏感性,促进凋亡诱导作用[15]。综上所述,本研究发现在顺铂治疗中Beclin1能够通过调控其表达水平来抑制细胞的自噬作用,加速凋亡的过程,能够一定程度上提高耐药细胞的敏感性。对于铂类药物同自噬基因之间的作用机制有待进一步研究,掌握确切机制阐明作用原理,能为治疗卵巢癌的提供一种新途径,对治疗卵巢癌及判断预后有一定意义,是该领域当前研究的方向之一。

    作者:任松森 吴松 程萍 单位:十堰市太和医院妇产科




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