太原同济医院中医肿瘤科
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    ESMO关于MSI检测的推荐以及MSI与TMB、PD1/PD-L1表达的

    发布时间:2020-05-21  来源:未知  作者:木木

    编译:月下荷花
    来源:肿瘤资讯

    错配修复缺陷(dMMR)肿瘤通常会发生超突变,并在易发生错配错误的单一形态的微卫星(短串联重复序列)中累积突变,这种情况称为微卫星不稳定(MSI),可以通过免疫组化(IHC)和分子方法PCR、二代测序(NGS)进行检测。MSI是Lynch综合征和结构性错配修复缺陷的标志,也是免疫治疗疗效的预测标志物,因此增加了肿瘤dMMR检测的需求。目前迫切需要确定如何检测以及更好地检测MSI,其前提是MSI定义标准化以及相关概念达成共识,如肿瘤突变负荷(TMB)、免疫检查点程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其配体PD-L1表达等。因此欧洲肿瘤学会(ESMO)发表了如下推荐。

    MSI及相关名词定义

    1. 微卫星定义

    微卫星,又称短串联重复序列,是基因组编码区和非编码区分布的重复DNA序列。微卫星由1~6个碱基的重复序列组成,虽然个体间具有高度多态性(重复序列数量不同),但在同一个体的胚系DNA和肿瘤体细胞DNA中长度通常相同,这种重复特性使得其对DNA不匹配错误更敏感。

    2. MSI定义

    MSI是一种遗传超突变状态,由有缺陷的DNA MMR所致。特征是微卫星突变聚集,通常是重复长度的变化。MSI的存在是MMR功能异常的表型证据。

    3. DNA MMR定义

    DNA MMR是一种高度保守的机制,用于错配时恢复DNA完整性,错配包括单碱基错配或短插入和短缺失。错配修复过程中有四个基因起到关键作用:MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2。其编码的同源蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2形成异二聚体,即MLH1-PMS2和MSH2-MSH6。其中任一基因失活(胚系和/或体系突变或表观沉默),都会导致MMR失活(dMMR)。

    专家评议:PMS2只能与MLH1、MSH6只能与MSH2形成异二聚体,但MLH1和MHS2可以与其他MMR蛋白形成异二聚体,如MSH3、MLH3和PMS1。通常,MLH1和MSH2突变会导致突变蛋白及其配对蛋白PMS2和MSH6的降解,但PMS2或MSH6突变可能不会导致其主要配对蛋白降解,因为在异二聚体中MSH6可被MSH3取代,而PMS2可被PMS1或MLH3取代。

    4. MSI/dMMR肿瘤定义

    dMMR肿瘤可积累数千个突变,多聚集于微卫星中,由重复长度变化组成,导致MSI。因此,MSI是dMMR的标志,显示细胞处于超突变状态。

    专家评议:任何与Lynch综合征相关的散发癌症(结直肠、子宫内膜、小肠、尿路上皮、中枢神经系统和皮脂腺)均应采用IHC和PCR检测dMMR/MSI。

    MSI的检测及相关推荐

    最常进行MSI研究的肿瘤类型(>60%)是转移性结直肠癌,其他肿瘤包括晚期子宫内膜癌、转移性前列腺癌、胃癌等。多数(>80%)研究采用IHC和分子检测方法定义MSI状态:IHC法时需检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四个MMR蛋白;PCR法时有两种检测组合,均包含5个微卫星位点,一种包括2个单核苷酸(BAT-25和BAT-26)和3个双核苷酸(D5S346,D2S123和D17S250)重复序列,另一种包括5个多聚腺苷酸单核苷酸重复序列(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27)。MSI定义为5个微卫星标志中≥2个稳定性丧失。此外,有研究使用NGS方法进行检测。

    1.推荐A:MSI检测的第一种方法是MMR IHC。IHC方法使用广泛,共检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四种MMR蛋白。

    专家评议:散发的、与Lynch综合征相关的癌症需使用IHC检测4种MMR蛋白。IHC检测主要是基于MMR蛋白在细胞核中广泛表达这一事实。多数MMR基因突变会干扰蛋白二聚体形成,导致异二聚体降解,从而导致蛋白表达缺失。因此,MLH1突变与IHC中MLH1和PMS2缺失相关,而MSH2突变与IHC中MSH2和MSH6缺失有关。

    但如果是PMS2和MSH6基因突变时,异二聚体可能保持稳定,配对蛋白也不会缺失,因为PMS2和MSH6蛋白的功能可被其他蛋白代偿,如MSH3代替MSH6,MLH3或PMS1代替PMS2。因此,PMS2抗体能检测所有携带MLH1或PMS2异常的病例,MSH6抗体能检测所有携带MSH2或MSH6异常的病例,但MLH1和MSH2抗体不能识别PMS2或MSH6异常的病例。

    IHC的缺点之一是,由于技术或生物原因,可能会导致假阳性和假阴性的免疫染色结果,从而不能反映MMR真实状态。导致假阴性的技术因素主要是检测前原因,如组织固定。也可见到异常染色模式,包括细胞质、点样或核周染色。内部阳性对照,如正常粘膜、淋巴细胞或基质细胞,是解释结果的必要条件。导致假阳性的生物学原因包括MMR基因错义突变,导致蛋白改变,功能失活但抗原仍完整,此外假阳性的生物学原因还可能与配对蛋白PMS2或MSH6(MSH3替代MSH6,MLH3或PMS1替代PMS2)被替代,导致MMR功能或活性缺陷有关。因此强烈推荐使用4种抗体进行检测,并在IHC解释有疑问时进行MSI-PCR检测(推荐B)。使用PMS2/MSH6双抗体筛查更符合经济效益,但在MSH6免疫染色阴性、局灶阳性或弱阳性的情况下,需要对MLH1和/或MSH2检测进行确认。事实上,4% MSI肿瘤中发现PMS2表达的单独缺失,单独PMS2或MSH6表达缺失可能是基因体突变所致。总之,推荐4种MMR蛋白检测,是同时还是先后检测可结合实际情况。

    IHC可在活检或手术标本上进行。活检IHC的主要优势是:(i)活检组织固定程度优于手术标本;(ii)可以在首次多学科会诊时就了解MSI状态,这可能会改变后续治疗,特别是转移时。手术标本IHC的优点是:(i)能分析更多的细胞;(ii)选择最佳IHC标本;(iii)有内部对照(如正常黏膜、炎症细胞),但这在活检标本中通常也存在;(iv)由于可分析更多组织,因此可能克服肿瘤异质性(特别是MSH6染色)的影响;(v)拟行免疫治疗前,还可在同一标本上进行PD-1和PD-L1的IHC检测。

    2.推荐B:IHC结果不确定时应进行MSI-PCR检测,包括IHC解释不一致或有困难,或仅缺失一个异源二聚体亚基(如仅有MLH1或PMS2缺失)。传统PCR分子检测MSI的2个组合中,BAT-25、BAT-26 、NR-21、NR-24、NR-27组合因其敏感性和特异性较高而更多推荐使用。MSI定义为5个微卫星标志中≥2个失去稳定性。

    专家评议:MSI-PCR可用于任何散发的属于Lynch综合征谱系肿瘤的dMMR检测(结直肠、子宫内膜、小肠、尿路上皮、胶质瘤/胶质母细胞瘤和皮脂腺)。Bethesda指南使用BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123、D17S25组合检测MSI。如果只有双核苷酸重复序列改变,则有必要进行单核苷酸重复序列的检测(如BAT40)。5个多聚腺苷酸单核苷酸重复序列的组合不需要正常组织比较,而且可能比其他微卫星标志更敏感。高MSI或MSI-L术语应摒弃,MSI-L肿瘤应纳入微卫星稳定肿瘤中。

    推荐A和B在结直肠癌中应用的特别评议:最近转移性结直肠癌免疫治疗的报告表明,高达10%的患者由于假阳性结果而进入免疫治疗研究,导致治疗失败。因此,专家推荐同时使用MMR-IHC和MSI-PCR评估转移性结肠直肠癌和其他Lynch综合征相关肿瘤免疫检查点抑制剂的治疗资格。

    3.推荐C:NGS是另一种评估MSI的方法,其主要优点是MSI分析与TMB测定可同时进行,而且NGS允许同时进行大量微卫星和基因高通量测序,因此有发现其他非免疫治疗靶点的可能。基于NGS的MSI检测有可能用于所有肿瘤的MSI检测。

    专家评议:NGS应在有经验的中心进行。未来,NGS对非单核苷酸重复序列的微卫星评估,可能有助于发现新的DNA修复功能障碍。

    MSI、PD-1/PD-L1表达和TMB的相互关系

    研究表明,同时存在高TMB、高MSI和PD-L1表达的肿瘤为2.9%,其中结直肠(12.8%)和食管腺癌(14.6%)的比例最高,同时存在高TMB和PD-L1表达或高MSI和PD-L1表达的肿瘤比例更高。

    最需要进行MSI检测的肿瘤类型为:子宫内膜、肠道(结直肠和小肠)、胃、食管(腺癌)、卵巢和胶质母细胞瘤。对于MSI频率较低、数据较少的肿瘤类型,应使用NGS进行MSI检测。值得注意的是,MMR缺陷肿瘤更常见于早期肿瘤(<Ⅳ期),晚期和转移性肿瘤中比例下降。专家强调,对不同类型肿瘤应采用不同的MSI检测策略,还应根据肿瘤类型、家族史和遗传咨询发现遗传性癌症综合征患者。

    对于MSI肿瘤,无需进一步分析TMB或PD-1/PD-L1表达来决定是否进行免疫治疗。PD-1/PD-L1表达变化很大,即使MSI阴性和/或低TMB病例中,也可有PD-1/PD-L1表达,还可能出现高TMB但无MSI的可能,不过高MSI时低TMB很少见(子宫内膜癌除外)。高TMB和高MSI高度一致的肿瘤主要有神经胶质瘤、结直肠癌和食管胃腺癌。肛门癌和食管鳞状细胞癌则为反比关系。这些肿瘤的特征与两个因素有关:人乳头瘤病毒(HPV)和吸烟。与HPV阴性或不吸烟肿瘤患者相比,HPV阳性和吸烟相关肿瘤具有更高的TMB,与MSI状态无关,同时也很好地解释了肛门癌和食管鳞癌中TMB与MSI间缺乏关联、不依赖MSI的PD-L1高表达。

    基因组分析表明,特定的突变特征可导致高TMB,与MSI状态无关,这些基因包括BRCA1/2、APOBEC缺陷、新抗原负荷、紫外线照射以及影响TP53和POLE的突变。MUC16突变可能与胃癌患更高TMB、更好的生存和免疫治疗反应相关。最后,MSI、TMB和PD-1/PD-L1表达的相互作用也受到其他肿瘤内外因素的影响,如肿瘤浸润淋巴细胞和微生物。

    TMB低、MSI缺失、甚至PD-1/PD-L1表达缺失的肿瘤,对免疫治疗的反应也存在很大差异,表明免疫治疗反应还可能受其他生物标志物的影响。如Epstein-Barr病毒(EBV)在诱发胃癌免疫治疗反应中发挥了关键作用,与TMB和MSI无关;在伴有淋巴样间质的胃癌中,PD-L1在肿瘤细胞上的表达不依赖MSI,也独立于EBV存在;黑素瘤并无MSI表现,但高TMB与PD-L1表达一致性的比例高达32%;非小细胞肺癌中MSI非常罕见(1.1%),但有高比例PD-L1阳性病例。

    虽然MSI、TMB和PD-1/PD-L1表达是免疫治疗选择患者的公认标志,但有必要对PD-1/PD-L1表达标准化,并在不同肿瘤类型中定义TMB界值。对于低TMB、缺乏MSI或缺乏PD-1/PD-L1表达的肿瘤需要新的预测免疫治疗反应的因子,NGS可能会大有作为,其最有前途的应用之一是在免疫治疗过程中进行监测,评估免疫治疗反应。

    参考文献

    Luchini C, Bibeau F, Ligtenberg M J L, et al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Ann Oncol, 2019. DOI:10.1093/annonc/mdz116. 

    责任编辑:Linda
    排版编辑:Linda




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